第二代测序信息处理

适读人群 ：第二代测序信息处理非常适用于从事生命科学研究的研究生和青年学者他们不仅可以在这里了解到不同软件的详细使用方法和参数设置、还可以在作者提供的软件评估和优化流程的基础上找到自身研究项目所需的第二代测序信息处理的最佳解决方案
《第二代测序信息处理》以30 多个美国国立卫生研究院资助项目的大量经验为基础，综合本领域著作并去粗取精，为读者提供了多种NGS 研究的全景展示，通过广泛使用的软件讨论数据分析方法，详述优工作流程（包括部分学习指南）。

　　《第二代测序信息处理》几乎涵盖了NGS 技术在生命科学领域的全部应用，包括从头测序（含基因组注释）、针对稀有变异检测和元基因组研究的扩增子测序、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、RNA 测序（RNA-seq）和肿瘤体细胞变异检测（包括单碱基替换、插入、缺失和易位）等。通过广泛使用的一线软件充分讨论数据分析方法，详述优工作流程（包括部分学习指南），实用性强、可靠性强、专业指导性强。

　　Stuart M.Brown是纽约大学医学院细胞生物学系助理教授、卫生信息学和生物信息学中心高级教职人员，同时是生物信息学咨询小组营运总监，也是序列信息学小组组长。他在纽约大学教授了12年生物信息学研究生课程，是生物信息学和医学基因组学教材的作者。Brown博士在康奈尔大学获得分子生物学博士学位。

《新生物学丛书》丛书序
译者前言
前言
1 DNA测序简介Stuart M. Brown
2 测序信息学的历史 Stuart M. Brown
3 第二代测序数据的可视化 Phillip Ross Smith，Kranti Konganti和 Stuart M. Brown
4 DNA序列比对Efstratios Efstathiadis
5 用广义 de Bruijn有向图算法组装基因组 D. Frank Hsu
6 用短序列读段从头组装细菌基因组 Silvia Argimon和 Stuart M. Brown
7 基因组注释 Steven Shen
8 使用第二代测序技术检测序列变异 Jinhua Wang，Zuojian Tang和 Stuart M. Brown
9 ChIP-seq Zuojian Tang，Christina Schweikert，D. Frank Hsu和 Stuart M. Brown
10 使用第二代测序进行 RNA测序 Stuart M. Brown，Jeremy Goecks和 James Taylor
11 元基因组学 Alexander Alekseyenko和 Stuart M. Brown
12 DNA测序信息学中的高性能计算 Efstratios Efstathiadis和 Eric R. Peskin
术语表
索引
彩图

　　《第二代测序信息处理》：
　　Sanger在 1975年发明的测序法通过 DNA聚合酶使人工合成的短寡聚核苷酸引物延伸，与单链 DNA模板杂交，合成新的 DNA片段。Sanger测序法的第一个版本使用双阶段 DNA合成反应。在第一阶段，测序引物利用 4种三磷酸脱氧核苷酸（ dATP、 dCTP、dGTP和 dTTP）的混合物进行部分延伸，生成一批新合成的 DNA片段，它们全部以引物为起始，延伸至“随机”长度。在第二阶段，部分延伸的模板被分成 4个平行的 DNA合成反应，每个反应只包括 4种三磷酸脱氧核苷酸中的 3种。“合成并尽可能在每条链上持续延伸：因此，如果 dATP是未加入的那个三磷酸盐，每条链都会在 3′端终止于 A残基前的位置”（Sanger and Coulson 1975）。接着，新合成的 DNA片段从模板链变性分离，通过丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道根据片段大小进行分离。“理想的情况下，能够通过放射自显影图像读取 DNA序列”（Sanger and Coulson 1975）（图 1.1）。
　　从各个角度来看，Sanger测序法都是具有革命性意义的。其中昀重要的是，它能对任何 DNA分子进行测序，它可以用来检测长 DNA序列。然而，这个系统在首次提出时有两个严重局限，导致它并未立刻被广泛采用。第一，对于寡聚核苷酸引物的需求意味着必须有一段与待测 DNA序列区域直接相邻的 DNA序列是已知的；第二，引物的“随机延伸”未必能生成平均分布的所有理论长度片段。
　　在 Sanger的“引物延伸”测序法发表短短两年后， Allan Maxam和 Walter Gilbert发明了一种基于 DNA化学裂解的测序方法（ Maxam and Gilbert 1977）。Maxam-Gilbert测序与 Sanger法类似，将 DNA模板分成 4个反应。在每个反应中，先在模板的 5′端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开 DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个 DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，和 Sanger法一样将 4个反应的产物加在丙烯酰胺凝胶的相邻泳道，通过电泳根据片段大小进行分离。昀后，通过对丙烯酰胺凝胶的放射自显影图像读取 DNA序列。起初，Maxam和 Gilbert测序相对于 Sanger测序更受欢迎，因为它能直接通过纯化后的 DNA片段进行测序，而不需要单链模板和互补寡聚核苷酸引物。
　　Sanger随即改进了他在 1975年提出的方法，他在引物延伸反应中使用双脱氧核苷酸作为“链终止子”代替复杂的双阶段反应（ Sanger et al. 1977）。改进后的测序法仍以单链 DNA模板和短互补寡聚核苷酸引物的杂交为起始。将杂交后的模板分成 4组反应混合物每组包括 DNA聚合酶、 4种三磷酸脱氧核苷酸（其中一种用放射性同位素标记）和一种双脱氧核苷酸。当引物在 DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上双脱氧核苷酸反应就会停止，随即生成不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。昀后，将 4个反应生成物加在丙烯酰胺凝胶上，通过电泳分离大小不同的片段，通过放射自显影图像读取 DNA序列。Sanger表示在一次电泳中能读取昀多 300个碱基的长度。
　　很多年来，Sanger的双脱氧核苷酸末端终止测序法和 Maxam-Gilbert的化学降解测序法一直被互相比较。也许是由于 Maxam-Gilbert法步骤烦琐并使用了有毒试剂，Sanger法越来越受欢迎。很多细化完善 Sanger法的研究方法被开发出来，包括多种跨待测基因（或整个基因组）的单链模板克隆方法和进行试剂准备流水作业的商业试剂盒。一项对 Sanger技术非常重要的改进是荧光染料取代了新合成 DNA片段上的放射性同位素标记（Smith et al. 1986）。由此促使 Leroy Hood、Michael Hunkapiler等开发出半自动 DNA测序仪，并且由美国应用生物系统公司（ Applied Biosystems Inc.，ABI）投入商业化生产。
　　ABI测序仪的重要创新包括将 4种不同颜色的荧光标记连接在 4种双脱氧核苷酸链终止子上，使 4个碱基终止的片段都在同一个反应管中生成，并且在同一块丙烯酰胺凝胶上进行电泳，通过电脑监控进行实时荧光检测，这样在凝胶电泳进行时序列数据就能被自动收集。人类基因组计划数据基本上都是由这些 ABI测序仪获得的。ABI自动荧光测序仪的另一处改进是用毛细管取代两个玻璃盘之间又大又薄的平板来盛放丙烯酰胺凝胶。这为测序实验室的技术人员节省了准备工作，保证了电泳结果的持续稳定并且提高了电泳速度，也使测序仪能够同时处理更多的样本（图 1.2）。
　　测序克隆
　　Sanger测序反应需要单链 DNA模板、与模板互补的短单链寡聚核苷酸引物、 DNA聚合酶及链延伸和链终止的核苷酸混合物。准备测序 DNA的常规策略是将 DNA的目标片段克隆到质粒载体上，质粒载体在可以被单链 DNA聚合酶Ⅱ使用的标准测序引物结合位点之间提供克隆位点。由此任何 DNA目标片段都可以通过标准寡聚核苷酸引物从两个方向被测序，因此不需要提前知道目标 DNA分子的序列（图 1.3）。用 Sanger法进行 DNA测序一次能读取 500~800个碱基，这个界限受两个因素影响，一是 Sanger引物延伸/链终止反应，二是通过单碱基分辨率用电泳准确区分 DNA片段的能力。由于多数研究人员感兴趣的生物学核酸分子（如基因、 mRNA转录物、质粒和基因组）都远比 800 bp长，DNA测序项目一般先将 DNA分子打成短片段，对短片段进行测序，再用生物信息学工具将数据组装成目标分子的完整序列。
　　对于较小的测序目标，基于限制性消化片段的策略颇为有效，但是却难以追踪所有序列组成片段的大小和方向。Henikoff在 1984年提出的策略包括通过核酸外切酶Ⅲ的有向消化生成逐级变小的 DNA片段，再将这些巢式序列通过重叠 read组装被构建成为重叠群（contig）的邻接序列。由于所有 DNA测序法都会产生少量错误，逐渐形成的标准流程是将全部目标区域中重叠的 read结合起来，在理想状态下 read来自 DNA分子的两个方向。将全部来自两个方向的重叠 read组装成为共有序列的方法成为 20世纪八九十年代软件开发的焦点。一篇发表于 1994年的综述（ Miller and Powell 1994）比较了 11个不同 DNA序列组装软件的性能。
　　……